Enzyme-free magnetic diagnostics circuit for detection of SARS-CoV-2 RNA
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Beschreibung
In der labormedizinischen Diagnostik gewinnen Nukleinsäuren zunehmend an Bedeutung, da sie zur Früherkennung von Krankheiten beitragen. Der Nachweis von pathogenspezifischer Desoxy-/Ribonukleinsäure (DNA/RNA) erfordert jedoch häufig eine umfangreiche und kostenintensive Probenpräparation, einschließlich Extraktion und enzymbasierter Amplifikation. Magnetische Assays, die auf magnetischen Nanopartikeln (MNP) und der Magnetischen Partikelspektroskopie (MPS) basieren, bieten großes Potenzial für den Nachweis von Pathogenen ohne vorherige Aufbereitung der Proben. Das magnetische Signal der MNP interferiert nicht mit dem typischen Signal des biologischen Hintergrunds, wodurch die Detektion von MNP auch in undurchsichtigen Probenmedien möglich ist. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung von portablen MPS-Geräten den Einsatz direkt am Point-Of-Care.
Im Allgemeinen vergrößert die Bindung von Molekülen an MNP deren hydrodynamisches Volumen, wodurch die Brown’sche Relaxationszeitkonstante der Partikel erhöht wird. Diese Änderung in der Relaxation kann mithilfe der MPS detektiert werden. Diese Arbeit umfasst die Entwicklung eines Nachweisverfahrens zur Detektion von pathogener RNA, welches auf Target-induzierten Declustering-Prozessen von reaktiven magnetischen Clustern basiert. Die Auflösung der Cluster erfolgt durch die Toehold-vermittelte DNA-Strangverdrängung. Spezifische Zielsequenzen binden an funktionelle Gruppen der Cluster und zerlegen diese sukzessive in ihre Grundbausteine, die einzelnen MNP. Im Gegensatz zum herkömmlichen Clustering-Ansatz wird hier das initiale hydrodynamische Volumen der Cluster reduziert, wodurch die Relaxationszeit verkürzt und das MPS-Signal verstärkt wird. Unter Zuhilfenahme verschiedener Methoden der DNA-Nanotechnologie wurde eine Verstärkerschaltung auf molekularer Ebene aufgebaut, welche als Magnetic signal Amplification Circuit (MAC) bezeichnet wird. Durch den Einsatz des MAC-Assays konnte die Sensitivität der untersuchten Assays um das Vierfache verbessert werden. Für die Detektion ganzer RNA-Genome musste die Schaltung um eine vorhergehende Initiierung erweitert werden. Es wird gezeigt, dass initiierte MAC-Assays in der Lage sind das vollständige RNA-Genom von in Zellkultur gezüchteten Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Proben nachzuweisen. Dies geschieht in einer Ein-Topf-Reaktion, ohne den Einsatz von Enzymen und unter isothermen Bedingungen (25 °C). Zum Vergleich der Sensitivität wurden Polymerase-Kettenreaktionen an denselben Elutionen durchgeführt und es wurden Zyklusschwellenwerte von bis zu 26 ermittelt. Darüber hinaus wird gezeigt, dass initiierte MAC-Assays SARS-CoV-2 von anderen humanen Coronaviren unterscheiden können. Zuletzt wurde eine Kostenanalyse durchgeführt, um die Wirtschaftlichkeit der Assays zu demonstrieren. Die hier entwickelten MAC-Assays eröffnen einen völlig neuen Ansatz für MPS-basierte magnetische Assays und erhöhen die Konkurrenzfähigkeit gegenüber anderen Detektionsplattformen erheblich.
Autor*in
Enja Laureen Rösch
Themen in »Enzyme-free magnetic diagnostics circuit for detection of SARS-CoV-2 RNA«
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