Identification of β-tubulin Isotypes and Development of Pyrosequencing Assays for Benzimidazole Resistance in Heterakis gallinarum and Ascaridia galli
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Beschreibung
"Identifizierung von β-Tubulin Isotypen und Entwicklung von Pyrosequenzierungs-Assays für die Analyse von Benzimidazole-Resistenz bei Heterakis gallinarum und Ascaridia galli"
Geflügel wird als eine der besten tierischen Proteinquellen für Menschen angesehen. Nach kürzlichen Änderungen in den Haltungssystemen für Geflügel in Europa von Käfig- zu alternativen Haltungsformen wie Freilandhaltung, wurden erhöhte Prävalenzen von Infektionen mit Helminthen, insbesondere Ascaridia galli und Heterakis gallinarum, beobachtet. Die grundlegenden Prinzipien für eine effektive Kontrolle von Helmintheninfektionen beim Geflügel vereinen eine Kombination von präventiven Maßnahmen wie Biosicherheit und Desinfektion mit der Anwendung von Breitspektrum-Anthelminthika. Die Benzimidazole Flubendazol und Fenbendazol wurden für die Behandlung von Hühnernematoden in der Europäischen Union zertifiziert und werden weithin als sichere Breitspektrum-Anthelminthika beim Geflügel eingesetzt. Benzimidazol(BZ)-Resistenz ist ein weit verbreitetes und bedeutendes Problem bei zahlreichen parasitischen Nematoden von Wiederkäuern und Pferden und wurde insbesondere mit dem Vorhandensein von drei Einzelnukleotidpolymorphismen (engl. Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) im β-Tubulin Isotyp 1 Gen von Strongyliden korreliert. Benzimidazol-Resistenz wurde jedoch bisher nicht für parasitische Nematoden der Hühner beschrieben. Grundsätzlich ist allerdings das Risiko für die Entwicklung von BZ-Resistenz bei Geflügelnematoden als gegeben einzuschätzen und wird mit erhöhter Infektionsintensität und Behandlungsfrequenz steigen. Daher ist es notwendig, sensitive und zuverlässige diagnostische Tests für die Detektion von BZ-Resistenz zumindest für die wichtigsten Nematoden der Hühner zu etablieren. Einzelnukleotidpolymorphismen im β-Tubulin Isotyp 1 Gen, insbesondere in den drei spezifischen Codons F200Y, E198A und F200Y, werden in der Veterinärmedizin als Marker zur Detektion von BZ-Resistenz in einigen Strongylidenspezies verwendet. Von den verfügbaren molekularen Verfahren wird Pyrosequenzierung als eine exzellente Technik für die Quantifizierung von mit BZ-Resistenz assoziierten β-Tubulinallelen angesehen, selbst wenn die Häufigkeit dieser Allele noch gering ist. Hier wurden partielle cDNAs eines bestimmten β-Tubulinisotyps mit Hilfe degenerierter Primer erhalten. Die neun gewonnenen A. galli cDNASequenzen waren 100 % identisch untereinander und zu einer zuvor publizierten Sequenz während die 40 neuen H. gallinarum 93-99% identisch untereinander und 88% identisch zu der A. galli Sequenz waren. Es wurde eine 1497 bp umfassende, vollständige β-Tubulin Isotyp 1 cDNASequenz mit einem offenen Leseraster von 1353 bp des Geflügel Nematoden H. gallinarum identifiziert. Eine phylogenetische Maximum-Likelihood Analyse zeigte, dass die beiden A. galli und H. gallinarum β-Tubulin cDNAs zusammen eine Gruppe bildeten und die gleiche phylogenetische Beziehung zu den anderen β-Tubulinen aus Ascariden aufweisen. Insgesamt ergab sich eine klare Aufteilung zwischen β-Tubulinen von Klade V- und Klade III-Nematoden. Die letzteren formten eine Gruppe mit hoher statistischer Unterstützung. Dies, zusammen mit der Tatsache, dass in beiden Gruppen mehrere Paraloge je Spezies gefunden wurden, verhindert die Identifizierung von eins-zu-eins Orthologen zwischen den β-Tubulinen von Ascariden und denen von Caenorhabditis elegans sowie denen der weiteren Strongylidenspezies. Zudem können solche eins-zu-eins Orthologe auch nicht im Vergleich zum Schweinespulwurm Ascaris suum identifiziert werden, denn die Schwestergruppe im phylogenetischen Baum zu der Gruppe aus A. galli und H. gallinarum enthält die A. suum tbb-1 und tbb-2 cDNAs. Pyrosequenzierungsassays für die quantitative Analyse der potentiell mit BZ-Resistenz assoziierten SNPs in den β-Tubulin Isotyp 1-Genen von A. galli und H. gallinarum wurden erfolgreich entwickelt. Plasmide mit artifiziell synthetisierten Insertionen wurden in definierten Verhältnissen gemischt, um die Sensitivität und Linearität der Assays zu evaluieren. Die Korrelation zwischen berechneter und gemessener Frequenz für die Bestimmung der SNPs in den Codons F167Y, E198A und F200Y war sehr hoch. Pyrosequenzierungsassays, die mit A. galli aus natürlich infizierten Hühnern von schwedischen Farmen durchgeführt wurden, ergaben keinen Nachweis für erhöhte Häufigkeiten von mit BZ-Resistenz assozierten β-Tubulin SNPs. Die entwickelten Assays erlauben es, die Entwicklung von Resistenz schon in einer frühen Phase nachzuweisen, bevor die Resistenz klinisch sichtbar wird. Dies eröffnet die Chance Maßnahmen zu implementieren, die einer weiteren Resistenzentwicklung entgegenwirken.
Autor*in
Vahel J. Ameen
Themen in »Identification of β-tubulin Isotypes and Development of Pyrosequencing Assays for Benzimidazole Resistance in Heterakis gallinarum and Ascaridia galli«
Ascaridia galli DANN sequencing DNA Heterakis gallinarum RNA benzimidazole drug resistance nucleotid sequencing tubulin