In silico genome analysis and molecular typing of Clostridium perfringens
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Beschreibung
"In silico Genomanalyse und molekulare Typisierung von Clostridium perfringens"
Hauptziele der Arbeit:
1. In silico-Untersuchung der genomischen Variabilität, phylogenetischen Verwandtschaft und Virulenzeinschätzung von C. perfringens mittels vergleichender Genomanalyse unter Verwendung öffentlich zugänglicher genomischer Daten.
2. Isolierung, Charakterisierung und Genotypisierung von C. perfringens Stämmen von gesundem und erkranktem Geflügel, die in verschiedenen landwirtschaftlichen Betrieben und Schlachthöfen in Ägypten gesammelt wurden.
3. Entwicklung und Anwendung eines Core-genom basierten Multilocus-Sequenz-Typisierungssystems für C. perfringens.
1. In silico-Untersuchung der genomischen Variabilität, phylogenetischen Verwandtschaft und Virulenzgene von C. perfringens
Das Gram-positive, anaerobe, sporenbildende Bakterium C. perfringens ist in der Lage, eine große Anzahl von Toxinen zu produzieren, wodurch es bei verschiedenen Wirten unterschiedliche definierte Krankheiten verursachen kann. Mit dem Ziel die genomische Vielfalt von C. perfringens zu untersuchen, wurden öffentlich verfügbaren Genomsequenzdaten von 76 Stämmen verschiedener ökologischer, geographischer und zeitlicher Herkunft analysiert. Die Datenanalyse umfasste 30 vollständige Genome, die aus einem ringförmigen Chromosom (2,9 bis 3,5 Mbp) und bis zu sechs extrachromosomalen Elementen bestanden. Ein erhebliches Maß an genomischer Variabilität wurde in Bezug auf Episom, Chromosomengröße und mobile Elemente festgestellt. Insertionssequenzen wurden identifiziert und die Häufung ihres Auftretens in bestimmten Genomen aufgedeckt. Das vergleichende Alignement vollständiger Genome zeigte einen erheblichen Grad an Konservierung in der Anordnung der Gene in jedem Chromosom, mit Ausnahme von drei (von den 30) Genomen. Die analysierten 76 C. perfringens Stämme wurden in drei verschiedene Phylogruppen (I - III) unterteilt. Phylogruppe I bestand aus lebensmittelvergiftenden Stämmen mit chromosomalem cpe sowie einem Darmbrand (Enteritis necroticans) Stamm. Diese Phylogruppe zeichnet sich durch eine signifikante Anreicherung mobiler Elemente, eine relativ kleine Genomgröße und einen deutlichen Verlust chromosomaler Gene aus. Den Phylogruppe I-Stämmen fehlen zwei mutmaßliche Eisen-Aufnahmesysteme sowie das pfoA Gen. Die genomischen Merkmale dieser Phylogruppe I (Fülle von IS-Elementen und Genomreduktion) liefern Hinweise darauf, dass sich diese Stämme an einen bestimmten Lebensraum anpassen, in welchem sie lebensmittelbedingte Krankheiten beim Menschen verursachen. Auch das Fehlen bestimmter Virulenzgene (Eisenaufnahmesysteme und PFO) deutet auf die Anpassung der Stämme an ein weniger kompetitives Umfeld (Lebensmittel) für die Replikation hin. Der Verlust chromosomaler Gene in der Phylogruppe I stand im Gegensatz zur Phylogruppe II, bei der die Genomgröße auf die Hinzugewinnung neuen Erbmaterials hinweist. Phylogruppe II-Stämme enthalten ein zusätzliches mutmaßliches Operon für Eisenaufnahme und eine zusätzliche Kopie des pfoA Gens. Stämme dieser Phylogruppe wurden häufig in verschiedenen Wirten (Pferd und Hund) beobachtet, bei denen sie enterische Läsionen verursachen können. In Summe liefert diese Studie neue Erkenntnisse über die genomische Variabilität und phylogenetische Struktur von C. perfringens. Phylogruppe I (chromosomale cpe- und Darmbrand-Stämme) scheint bestimmten evolutionären Mechanismen ausgesetzt und weist Merkmale auf, die auf eine Artbildung dieser Stämme hinweisen.
2. Charakterisierung und Genotypisierung von C. perfringens Stämmen aus gesundem und erkranktem Geflügel in Ägypten
Um die Vielfalt der C. perfringens Geflügelstämme in Ägypten zu untersuchen, wurden 54 Vögel aus 27 Betrieben mit Verdacht auf nekrotische Enteritis (NE), sowie 50 gesunde Vögel (10 Enten, 40 Hühner) aus acht Schlachthöfen untersucht. C. perfringens wurde aus NE-verdächtigen Vögeln von 14 verschiedenen Betrieben isoliert (n = 51 Isolate), sowie aus augenscheinlich gesundem Geflügel in Schlachthöfen (n = 83 Isolate). Die C. perfringens Isolate aus NE-Verdachtsfällen in Ägypten gehörten zum Toxin-Typ A und waren netB negativ, obwohl NetB-Toxin eine wichtige Rolle bei der NE-Pathogenese spielen soll. Das beta2-Toxin-Gen wurde sowohl bei kranken als auch bei gesunden Vögeln nachgewiesen. Zehn Isolate von fünf gesunden Enten, die auf Blutagar nicht die typische Doppelzonen-Hämolyse zeigten, wurden identifiziert. Darüaber hinaus wurde bei sieben Isolaten aus zwei NE-Verdachtsfällen die Insertion eines DNA-Segments von 834 bp im Amplikon des Alpha-Toxin-Gens nachgewiesen. Das inserierte DNA-Segment war identisch mit einem Gruppe II Intron. C. perfringens Stämme, die ein Intron der Gruppe II tragen, wurden zuvor in Japan, Italien und Dänemark gefunden. Interessanterweise wurde die Insertion bisher nur bei Hühnerisolaten nachgewiesen.
Zusätzlich wurde eine Pilotuntersuchung basierend auf klassischer MLST durchgeführt, um die genetische Verwandtschaft von C. perfringens bei einzelnen erkrankten Vögeln zu bestimmen. Die untersuchten Isolate von zwei Vögeln (Vogel Nr. 1 und Nr. 2) gehören jeweils zu einem einzigen MLST-Sequenztyp (ST45 und ST46) in Übereinstimmung mit verschiedenen Berichten, die eine begrenzte Vielfalt von Stämmen bei von NE betroffenen Vögeln beschrieben. Allerdings gehörten die Isolate von Vogel Nr. 3 zu drei verschiedenen STs. Der Vergleich der MLST-Daten für die 12 Stämme dieser Studie mit den in früheren Untersuchungen beschriebenen MLST-Daten ergab, dass die 12 Stämme neuen STs zugeordnet wurden und nicht zu den zuvor beschriebenen "NE-assoziierten" Genotypen (ST31, CC-4) gehören.
3. Entwicklung und Anwendung eines Core-genom basierten Multilocus-Sequenz-Typisierungssystems für C. perfringens
Die Ganzgenomsequenzierung kann einen vollständigen Überblick über die genetische Information eines Organismus geben, stellt aber auch ein leistungsfähiges molekularepidemiologisches Werkzeug für die Subtypisierung von Krankheitserregern und die Untersuchung von Ausbrüchen dar. In dieser Studie wurde ein cgMLST-Schema mit 1.450 Genen für die Typisierung von C. perfringens entwickelt. Das entwickelte Schema wurde auf ein Set von 160 Genomen angewendet. Durchschnittlich 99,5% der cgMLST-Ziele wurden pro Genom als typisierbar gewertet. Das Schema hat eine größere diskriminatroische Power als die klassischen MLST-Methoden. Darüber hinaus wurde eine Gesamt-Genom basierte SNPTypisierung durchgeführt. Die Trennschärfe zwischen der cgMLST und der Gesamt-Genom SNP-Typisierung war vergleichbar. Das entwickelte cgMLST-Schema wurde mit einem Clustertyp (CT)-Schwellenwert von 60 allelischen Differenzen angewendet, um 87 Genome von Geflügelstämmen von C. perfringens zu analysieren. Basierend auf den cgMLSTErgebnissen enthielten die meisten Clustertypen (CTs) Isolate, die nur aus einem einzigen Land stammen. Andererseits beherbergen nur wenige CTs Stämme, die in verschiedenen Ländern isoliert wurden. Dies könnte auf das Geflügelhandelssystem zurückzuführen sein, das wahrscheinlich von wenigen Unternehmen unterhalten wird, d.h. von wenigen Quellen weltweit. Im Vergleich zu Isolaten von gesunden Vögeln und aus Fleischproben, wurde bei den vermeintlichen nekrotische Enteritis (NE) Isolaten aus Ägypten eine begrenzte Vielfalt festgestellt, was die Hypothese stützt, dass bestimmte Isolate NE verursachen. Isolate von kranken Vögeln wurden mit Isolaten von gesunden Vögeln oder Fleischproben gruppiert, dies unterstreicht den multifaktoriellen Charakter der Krankheit und die weite Verbreitung potenziell virulenter Stämme.
Zusätzlich konnten die 160 in dieser Studie untersuchten Genome mittels hierBAPS in vier Hauptphylogruppen eingeteilt werden. Die Gesamt-Genom SNP-Typisierung zeigte eine überlegene Eignung zur Abgrenzung dieser Phylogruppen. Zwischen den Phylogruppen wurde eine minimale SNP-Differenz von ~ 40.000 SNPs beobachtet.
In Summe wurde ein gut anwendbares cgMLST-Schema für C. perfringens entwickelt, das für breite und standardisierte epidemiologische Untersuchungen verwendbar ist. Andererseits kann die Gesamt-Genom SNP-Typisierung die Zugehörigkeit einzelner Isolate zu den Hauptphylogruppen von C. perfringens detaillierter abbilden.
Autor*in
Mostafa Y. Abdel-Glil
Themen in »In silico genome analysis and molecular typing of Clostridium perfringens«
C. perfringens Clostridium perfringens Genomanalyse Genome genome analysis genomes molekulare Typisierung phylogenetics polymerase chain reaction