NMR Studies of the Protonation and Hydration of Basic Polypeptides

Beschreibung

Zusammenfassung in englisch und deutsch Abstract in englisch and german (englisch / english) Solid- and liquid-state 15N- NMR measurements have been employed to study the influence of protonation and hydration on basic polypeptides. They serve as model systems of basic amino acid side chains in proteins. For this purpose the two 15N labeled homo-polypeptides 15Nε poly-L-lysine and 15N3 poly-L-histidine were synthesized. In the first stage of this study, solutions of side chain 15N labeled poly-L-lysine exhibiting different pH values were prepared and either characterized by liquid-state NMR or, after lyophilization, by solidstate NMR as a function of the water content. In addition, an ion free, basic, dry lyophilizate was protonated by exposition to hydrogen chloride gas and investigated in solid-state. The aqueous solutions show the expected behavior upon titration. The side chain 15Nε signal shifts continuously from lowfield at -5.80 ppm for the fully protonated sample at pH 0.5 to highfield at -13.65 ppm for the deprotonated sample at pH 13.0. No continuous shift of an isotropic signal, as in liquid state, is found for the dry lyophilizates. A new, broad signal is observed in spectra of samples in the region from pH 9.0 to 11.4. This signal is almost 20 ppm wide and borders the signals of the fully protonated and spanns upfield completely covering the area of the signals of deprotonated samples. It displays changing intensities of its lowfield and highfield component. With increasing pH the intensity of the lowfield component decreases while that of the highfield component, which can be attributed to the fully deprotonated species, increases. The low field component is assigned to homoconjugated pairs of amino side chain groups in a hydrogen bridge with an anionic partner balancing the charge. Another aspect derived from the investigations of poly-L-lysine is related to the water content of solid samples and its effect on the 15N chemical shift. The spectra of partially hydrated solid samples shows intermediate shifts with respect to those of liquid and dry solid samples. The spectra of protonated samples show distinct broad signals that are assigned to lysine residues hydrogen bridged to increasing numbers of water molecules while moving upfield. The 15N chemical shifts of all spectra were gathered, plotted and analyzed by fitting the data with the Henderson-Hasselbalch relationship. The results for all three sample types demonstrated that the side chain amino group of poly-L-lysine is a good probe for the determination of the protonation state. The side chain amino group titrates in liquid-state with a pKa of 9.84 ± 0.20. The value deduced for solidstate spectra was calculated to a pKa of 10.1 ± 0.2. Similar investigations were attempted for poly-L-histidine. Liquid-state measurements are not possible over the whole pH range, since samples above pH 6.6 are increasingly water insoluble. The 15N solid-state spectra of lyophilizates of 15N3 poly-L-histidine from solutions with pH values from 0.5 to 11.0 were recorded. The spectra display combined highfield signals for the protonated Nτ and Nπ nitrogen groups at ~135 ppm. In the spectra from samples above pH 5.1 an additional signal for the deprotonated Nπ is observed at about 210 ppm. Both signals show a shift of about 8 ppm with changing pH. But neither an intermediate isotropic signal, as observed in liquid, nor a broad homoconjugated signal, as found in poly-L-lysine appears. The degree of protonation is well displayed by the change of intensity of the deprotonated and protonated signal. These intensities and the change of chemical shift of the individual signals over the pH range affords data that can again be fitted by the Henderson-Hasselbalch equation. The average of the pKa values deduced from the different curves leads to a pKa of 5.4 ± 0.4. Rehydration of the poly-L-histidine samples did not lead to any noteable changes in the 15N spectra. Additionally, some samples were investigated by 13C solid-state NMR. The 13C spectra of poly-Lhistidine give a definitive support for the assumption of a β-sheet structure in solid state. The related chemical shifts are found for samples at all investigated pH values. The 13C spectra of poly-L-lysine are more diverse. Even for samples prepared from solutions of the same pH the 13C spectra indicate different structures. The structural features are strongly influenced by preparatory methods such as drying time and concentration. (deutsch / german) Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Protonierung und Hydratation von basischen Polypeptiden mittels Flüssigkeits- und Festkörper-15N-NMR-Spektroskopie untersucht. Diese Verbindungen dienen als Modellsysteme für basische Seitengruppen in Proteinen. Zu diesem Zweck wurden die beiden 15N markierten Homopolypeptide 15Nε Poly-L-Lysin und 15N3 Poly-L-Histidin synthetisiert. Lysins hergestellt und mittels Flüssigkeits-NMR vermessen. Lyophiliserte Proben wurden, unter Beachtung des Wassergehalts, mittels Festkörper-NMR vermessen. Zusätzlich wurde ein ionenfreies, basisches, trockenes Lyophilisat, durch Behandlung mit gasförmigem Chlorwasserstoff protoniert und vermessen. Die Titration der wäßrigen Proben zeigte das erwartete Ergebnis. Die 15Nε-Signale ändern Ihre chemische Verschiebung kontinuierlich von -5.80 ppm für protonierte Proben bei einem pH Wert von 0.5 nach -13.65 ppm für deprotonierte Proben bei einem pH-Wert von 13.0. Im Kontrast zu den schmalen Signalen in flüssiger Phase, sind die Signale für die festen, getrockeneten Proben von pH 9.0 bis 11.4 stark verbreitert und umfassen fast 20 ppm. Das Intensitätsverhältnis von Tieffeld- zu Hochfeldkomponente des Signals verändert sich mit steigendem pH. Dabei nimmt die Intensität der Hochfeldkomponente, die den deprotonierten Aminogruppen zugeordnet ist, zu. Die Komponente bei tiefem Feld ist homokonjugierten Paaren von Aminogruppen zuzuschreiben, deren Ladung von einem wasserstoffbrückengebundenen Anion ausgeglichen wird. Ein weiterer Aspekt bei der Untersuchung von Poly-L-Lysin ist der Zusammenhang zwischen Wassergehalt und 15N chemischer Verschiebung. Die Verschiebung der Signale teilhydratisierter Proben liegen zwischen denen, die in den Spektren von getrockneten festen Proben und flüssigen Proben zu finden sind. Die Spektren protonierter Proben zeigen zudem noch breite Signale mit ausgeprägten Maxima, denen mit steigendem Feld eine zunehmende Anzahl von Wassermolekülen in Wasserstoffbrücken zum Stickstoff zugeordnet wird. Die 15N chemische Verschiebung aller Spektren wurde gegen den pH-Wert aufgetragen und anschließend durch Anpassung der Henderson-Hasselbalch Beziehung simuliert. Es konnte gezeigt werden, daß bei den drei untersuchten Probenarten die 15N chemischen Verschiebung eine gute Sonde für den Protonierungsgrad darstellt. Aus den Daten der Messungen in flüssiger Phase ist es möglich einen pKs Wert von 9.84 ± 0.20 abzuleiten. Dieses ist ebenfalls möglich für die entsprechenden Daten der Festkörpermessungen mit einem pKs Wert von 10.1 ± 0.2. Die 15N-Festkörper-NMR-Messungen an Lyophilisaten von 15N3-Poly-L-Histidin aus Lösungen mit einem pH Wert von 0.5 bis 11.0 wurden durchgeführt. Die Spektren zeigen gemeinsame Signale für die protonierten Nτ und Nπ Stickstoffgruppen im Hochfeldbereich bei ca. 135 ppm. Die Spektren der Proben mit einem pH Wert über 5.1 zeigen zusätzlich ein Tieffeldsignal für deprotonierte Nπ Stickstoffatome bei ca. 210 ppm. Es wurde jedoch weder ein schmales, dazwischenliegendes, Signal, wie bei den flüssigen Messungen am Monomer, noch ein breites Signal, wie bei Polylysin beobachtet. Die Intensitäten der protonierten und deprotonierten Nπ-Gruppe ermöglichen jedoch eine gute Beurteilung der Protonierungsverhältnisse. Sowohl diese Intensitätsverhältnisse, als auch die chemische Verschiebung, liefern Daten, die mit Hilfe der Henderson-Hasselbalch Beziehung die Ableitung von pKs Werten ermöglichen. Der Mittelwert der aus den verschiedenen Kurven abgeleiteten pKs-Werte errechnet sich zu 5.4 ± 0.4. Die lyophilisierten Poly-L-Histidin-Proben wurden rehydratisiert. Es konnten jedoch keine nennenswerten Veränderungen gegenüber den 15N-Spektren der trockenen Proben beobachtet werden. Zusätzlich durchgeführte 13C-Festkörper-NMR-Untersuchungen an Poly-L-Histidin und Poly-L-Lysin wurden herangezogen und gaben Auskunft über die Sekundärstruktur der Proben. Die Messungen an Poly-L-Histidin bestätigen deutlich die Annahme einer β-Faltblatt-Struktur im Festkörper. Untersuchungen an Poly-L-Lysin ergaben ein weniger eindeutiges Resultat. Selbst für Proben, die aus Lösungen des gleichen pH Wertes lyophilisiert wurden, konnten Signale für unterschiedliche Sekundärstrukturen beobachtet werden. Die Struktur wird offenbar stark durch die Herstellungsbedingungen der Proben, wie z.B. Konzentration und Trocknungszeit beeinflußt.

Autor*in

Volkmar Schimming

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