Untersuchung und Optimierung der polykationischen transienten Transfektion vom analytischen Maßstab bis zur rekombinanten Proteinproduktion im Bioreaktor

Beschreibung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der transienten Transfektion von Säugerzellen mit linearen, sternförmigen, micellierten und funktionalen Polykationen. Dabei wurden die Polyplexe der Polymere m-PDMAEMA, Si-PDMAEMA230/20, L-PEI und PHMG-b-PCLx mittels Gelretardation, Leitfähigkeitsmessung und Partikelgrößenanalyse charakterisiert. Die Untersuchungen zur Membranaktivität der Polymere zeigten einen effizienteren Gentransfer von sternförmigen Polykationen, vermutlich durch transiente Nanoporen. Im Vergleich zu L-PEI verlängerte sich zwar der zytoplasmatische Transport der pDNA in den Zellkern, allerdings lassen eine höhere Transfektionseffizienz und eine deutlich stärkere Expression auf mehr pDNA im Zellkern schließen. Für die Untersuchung des Einflusses der verwendeten DNA-Sequenz, wurden drei unterschiedliche Fluoreszenzproteine unter der Kontrolle eines zellulären und drei viraler Promotoren in Jurkat-, HEK-293-, L929- und CHO-K1-Zellen erforscht. Die aufgezeigten Einflüsse der Promotoren oder Transgene auf die Transfektion waren gravierend. Co-Transfektionen von Reporterproteinen waren in allen Zelllinien möglich, wobei einige Zellen stets nur ein Protein exprimieren konnten. Weiterhin verdeutlichten die Versuche zur Plasmidverdünnung, dass oftmals deutlich weniger pDNA eine vergleichbare Transfektionseffizienz bewirkt und lediglich die Expressionsstärke von der eingesetzten pDNA-Menge abhängt. Neben der Erforschung der Grundlagen im analytischen Maßstab sind weitere Ziele dieser Arbeit der Scale-up einer Transfektionsdurchführung und eine rekombinante Proteinproduktion im Bioreaktor. Dazu wurde eine direkte Transfektionsdurchführung etabliert. Eine separate Polyplexbildung war somit nicht mehr erforderlich, wodurch das Transfektionsprotokoll einfacher, reproduzierbarer und skalierbarer wurde. Zur weiteren praktischen Anwendung der direkten Transfektion wurden 109 HEK-293-Zellen transient transfiziert und im Anschluss in einem 1-L-Bioreaktor das Protein hBMP2 produziert. Neben HEK-293-Zellen war die Etablierung der Hochzelldichtetransfektion von Jurkat-Zellen von besonderem Interesse. Für diese empfindliche und schwer zu transfizierende Zelllinie konnten überaus erfolgreiche Transfektionseffizienzen erreicht werden.

Autor*in

Alexander Raup

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Genom Gentransfer Immundefekte

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