Triostin A And Analogues: Synthesis and DNA Recognition
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Beschreibung
Ein großes Ziel der Pharmaforschung ist die Erkennung von verschiedenen Sequenzen und abasischen Positionen der DNA durch kleine Moleküle. Diese spezifischen Wechselwirkungen sind nötig um eine Kontrolle über Genexpression und DNA-Replikation zu haben und führen demzufolge zu antibiotischen und zytotoxischen Wirkungen.
Die Chinoxalin-Antibiotika, wie Triostin A, gehören zu den häufig erforschten Naturstoffen für die Entwicklung von neuen therapeutischen Mitteln. Sie binden mit hoher Sequenzselektivität und -spezifität über die kleine Furche via Interkalation an den DNA-Doppelstrang. Das rigide zyklische Rückgrat dieser Depsipeptide präorganisiert die interkalierenden Chinoxalin-Einheiten in eine parallele Orientierung mit einem Abstand von etwa 10.5 Å. Die Sequenz-spezifität kommt durch spezifische Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren der DNA und den Aminosäuren des depsipeptidischen Rückgrats zustande. Die beiden Chinoxalin-Einheiten sorgen durch Bisinterkalation und van-der-Waals-Wechselwirkungen für eine hohe Bindungsaffinität.
Die vorliegende Arbeit hat ihren Schwerpunkt in der Totalsynthese des Naturstoffes Triostin A und seinen teilweise methylierten Nukleobasen-Analoga unter Verwendung der orthogonalen Schutzgruppenstrategie. Obwohl in unserer Arbeitsgruppe mit Hilfe dieser Strategie schon viele verschiedene Triostin A-Analoga synthetisiert werden konnten, war die Darstellung des teilweise methylierten Triostin A-Rückgrats 11 (Abbildung 5.1) eine Herausforderung.
Abbildung 5.1: Teilweise methyliertes und orthogonal-geschütztes Depsipeptidrückgrat von Triostin A.
Das Peptidrückgrat, welches zum Teil methyliert vorliegt, ist für die spezifischen Wechselwirkungen mit dem DNA-Doppelstrang verantwortlich und führt zu einer CpG-Sequenzselektivität des Triostin, welches zwei gleiche interkalierende Chinoxalin-Einheiten besitzt. Die Verbindung 11 stellt ein Schlüssel-Intermediat bei der Synthese des Naturstoffes Triostin A dar. Triostin A selbst besitzt zwei identische Chinoxalin-Einheiten, wobei vier seiner Analoga jeweils über zwei unterschiedliche Nukleobasen verfügen (Abbildung 5.2).
Moderne Synthese Protokolle für die Peptidsynthese in Lösung wurden etabliert um das Gerüst des Depsipeptids 11 aufzubauen, welches vier verschiedene Aminosäuren und die beiden unterschiedlichen Schutzgruppen (Fmoc und Z) enthält, wobie jede Aminosäure zweimal eingebunden ist. Die Verknüpfung der zwei linearen Tetradepsipeptide, die jeweils aus vier gleichen Aminosäuren und einer Aminosäure, die die Schutzgruppe trägt, bestehen, führt zum linearen Oktadepsipeptid. Nach Ausbildung der Disulfidbrücke wird durch Makrolactamisierung das zyklische Rückgrat 11 erhalten. Nach diesem Schritt werden die verschiedenen Schutzgruppen selektiv entfernt und die Kupplung mit den verschiedenen Einheiten ergibt die gewünschten Einzelverbindungen.
Abbildung 5.2: Triostin A (links) und eins der vier synthetisierten Nukleobasen-Analoga von Triostin A (rechts).
Die Struktur des Triostin A wurde NMR-spektroskopisch untersucht. Für die entsprechenden Analoga wurden hingegen auch UV- und FID-Spektren aufgenommen, um die Bindungseigenschaften mit kurzen DNA-Strängen (10 Basenpaare) zu untersuchen. Triostin A zeigte in den NMR-Spektren die Anwesenheit von zwei Konformationen in CDCl3 im Verhältnis von 2:1. Die anderen vier Nukleobasen-substituierten Triostin A-Analoga lagen in [D6]-DMSO in nur einer Konformation vor. Aufgrund der schlechten Löslichkeiten der Analoga in unpolaren Lösungsmitteln wurden davon keine Spektren aufgenommen.
Zur Untersuchung der Bindungsaffinitäten und verschiedenen Interaktionsmöglichkeiten der synthetisierten Moleküle mit DNA wurden zwei kurze DNA-Stränge mit G-C-reichen Regionen gewählt, von denen ein Strang eine abasische Position enthält. Wegen der Ähnlichkeit des peptidischen Rückgrats der dargestellten Peptide mit dem des Triostin A’s, wurden G-C-reiche DNA-Stränge verwendet. Das Adenin-Thymin substituierte Triostin A-Analogon 10 zeigte ein Maximum der Fluoreszenzabnahme mit beiden intakten DNA-Strängen genauso wie mit der abasischen DNA. Alle Verbindungen wiesen in UV-Schmelztemperaturen eine Stabilisierung der modifizierten DNA auf, während die Analoga 9 und 10 zu einer Destabilisierung des intakten DNA-Hairpins führten (Abbildung 5.3).
Abbildung 5.3: Links: Schmelztemperaturen von DNA-1 und DNA-2 (mit abasischer Position) unter Ausbildung des Komplexes mit den Verbindungen 6, 7, 8, 9 und 10; Rechts: Schwankungen der % Abnahme der Fluoreszenz aller Komponenten 6, 7, 8, 9 und 10 mit DNA-1 und DNA-2 (rechts).
Neben der Interkalation sind auch andere Arten der Interaktion mit den Nukleobasen-funktionalisierten Analoga möglich, da die Nukleobasen sowohl Akzeptor- als auch Donor-Wasserstoffbrückenbindungsseiten zur Verfügung stellen. Die Kokristallisation von Triostin A-Analoga mit doppelsträngiger DNA, um die Art der Interaktionen genau bestimmen zu können, konnte bisher noch nicht erfolgreich durchgeführt werden.
Obwohl die konformationelle Rigidität des octadepsipeptidischen TANDEM-Rückgrates ein entscheidender Faktor für die DNA-Bindungsaffinität ist, weist auch das lineare und damit flexiblere Octapeptid H-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-Tyr-OH eine gute DNA-Bindung in Form von intercalatorischen Wechselwirkungen auf. Die vom C-terminalen tandem repeat der RNA Polymerase II abgeleitete Sequenz wurde N-terminal um eine Tyrosin-Einheit verlängert. Durch intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen wird eine Triostin A-ähnliche Konformation generiert, wobei sich der gebundene Zustand von der Struktur des freien Peptides unterscheidet.
In dieser Arbeit wurde versucht, die durch Wasserstoffbrücken-vermittelten β-Turns durch kovalent-verbundene 9-Ringe zu ersetzen. Auf diese Weise soll eine Versteifung des Peptidrückgrates erreicht und die Bindung an den DNA-Doppelstrang via Bisintercalation deutlich verstärkt werden. Weiterhin sollte der Ersatz der Tyrosinbausteine durch Nukleobasen-funktionalisierte Aminosäurederivate die Intercalationsfähigkeit weiter verbessern.
Aus diesem Grund wurden Versuche unternommen das cyclische Derivat 5 in Lösung darzustellen, um es anschließend in der Peptid-Festphasensynthese (SPPS) zur Darstellung nukleobasen-funktionalisierter Peptide 4 einzusetzen (Abbildung 5.4).
Alle Versuche eine entsprechende Zyklisierung vorzunehmen waren nur bei Verwendung eines D-Prolinderivates mit der Synthese von Verbindung 62 erfolgreich (Abbildung 5.4). Dieser Effekt lässt vermuten, dass der Prolinring und dessen Konformation einen entscheidenden Einfluss auf die Bildung des gewünschten 9-Ringes ausübe.
Auch wenn es nicht möglich war Verbindung 70 darzustellen (Abbildung 5.6), so lässt sich mit der gelungenen Darstellung des anderen Diastereomers 62 und dessen Verwendung in der Festphasensynthese konformationell starrer Peptide wie Verbindung 4 ein Eindruck gewinnen, welche Wirkung die vorgenommen Modifikationen auf die Struktur der betrachteten nukleobasen-funktionalisierten Octapeptide hat.
Figure 5.4: Molekülstrukturen der zyklischen Bausteine 5, 70, 62 und des gewünschten bizyklisierten DNA-Bisintercalators mit versteifter Rückgratstruktur und Nukleobasenfunktionalitäten 4.
Zuletzt wurden in dieser Arbeit auch nicht-kovalent gebundenen Komplexe nukleobasen-funktionalisierter β-Peptide mittels FTICR-ESI-Massenspektrometrie untersucht. Die FTICR-ESI-MS ist eine Technik, die heutzutage eine breite Anwendung bei der Aufklärung nicht-kovalenter Wechselwirkung zwischen Biomolekülen findet (Appendix 8.2).
Unter Verwendung des Pentabromopseudilins, eines cytotoxischen Naturstoffes, wurde die Entfernung von Nukleobasen mittels FTICR-ESI-MS verfolgt. Diese Untersuchungen zeigten eine selektive Entfernung der Nukleobase Adenin aus dem G-C-reichen ‚Dickerson Dodecamer‘ (Appendix 8.1).
Mit weiteren, detaillierteren Studien dieser Art sollte es möglich sein den Mechanismus der Basenentfernung durch das Pentabromopseudilin aufzuklären, der die Grundlage für dessen cytotoxische Wirkung bildet.
The recognition of distinct sequences and abasic positions in DNA by small molecules has been a major target in the field of drug discovery. These specific interactions are necessary for controlling gene expression and DNA replication, and hence, lead to the antibiotic and cytotoxic activities.
Quinoxaline antibiotics like Triostin A belong to the widely studied natural products for the development of new potential therapeutic agents. They bind to DNA double strands via intercalation into the minor groove with high sequence selectivities and specificities. The rigid cross-bridged cyclic backbone of these depsipeptides preorganizes the attached quinoxaline intercalating moieties parallely at a distance of approximately 10.5 Å. The sequence specificity originates from specific hydrogen bonding between nucleobase pairs in the double-stranded DNA and amino acids in the depsipeptidic backbone, while the bisintercalation of the two quinoxaline moieties and van der Waals interaction provide the high binding affinity.
This work is focused on the total synthesis of the natural product, Triostin A and its partially methylated nucleobase-functionalized analogues employing an orthogonal protecting group approach. Although various Triostin A analogues have already been synthesized in our group using this strategy, the preparation of the partially methylated Triostin A backbone 11 (Figure 5.1) in a substantial amount was challenging.
Figure 5.1: Partially methylated and orthogonally protected depsipeptide backbone of Triostin A and its analogues.
This partially methylated peptide backbone is responsible for specific interactions with double-stranded DNA and leads to the CpG sequence selectivity of Triostin A bearing two similar quinoxaline intercalating units. The molecule 11 is a key intermediate in the synthesis of the natural product, Triostin A containing two identical quinoxaline units and four of its analogues where each has two different nucleobase units (Figure 5.2).
Modern solution phase peptide synthesis protocols were employed to build the scaffold of depsipeptide 11 consisting of four different amino acids, each being incorporated twice, and two different protecting groups (Fmoc and Z). Linkage of the two linear tetradepsipeptides, each containing four similar amino acids and one different protecting group afforded the linear octadepsipeptide. Disulfide bond formation was followed by macrolactamization to provide the cyclic backbone 11. In this scaffold, selective removal of the protecting group followed by coupling with an appropriate moiety resulted into the desired compounds.
Figure 5.2: Triostin A (left) and one of the four prepared nucleobase analogues of Triostin A (right).
NMR spectroscopy was used to study the structures of Triostin A and the respective analogues while UV and FID experiments were carried out to study the binding properties with short double-stranded DNA (10 base pairs). Triostin A showed the presence of two conformations in CDCl3 in the ratio of 2:1 in NMR spectra. All other four nucleobase-functionalized Triostin A analogues were present in one conformation in [D6]DMSO, although their spectra were not recorded in non-polar solvent due to their poor solubilities.
In order to study binding affinities and modes of interaction of these synthesized molecules with DNA, two short DNA systems with a G-C rich sequence, one of which contained an abasic site, were selected. Due to similarity of the peptidic backbone of the synthesized compounds with that of Triostin A, G-C rich DNA systems were chosen. The adenine-thymine substituted Triostin A analogue 10 showed the maximum decrease of fluorescence with both intact DNA (DNA-1) as well as modified DNA with an abasic site (DNA-2). All compounds showed the stabilities with modified DNA while the two analogues 9 and 10 destabilized the intact DNA hairpin as indicated by UV melting temperatures (Figure 5.3).
Figure 5.3: Left: Melting temperatures observed in DNA-1 and DNA-2 (with abasic position) when complexed with compounds 6, 7, 8, 9, and 10 respectively; Right: variations of the % decrease in fluorescence shown by all compounds 6, 7, 8, 9, and 10 with DNA-1 and DNA-2 (right).
Apart from the intercalation, other modes of interaction are also possible with nucleobase-functionalized analogues due to the presence of the hydrogen bond acceptor/donor sites in nucleobases. The co-crystallization experiments of the Triostin A analogues with double-stranded DNA are still in progress in order to know their exact nature of interaction.
Although the backbone rigidity of the octadepsipeptidic molecules is crucial for the DNA binding, a more flexible linear octapeptide, H-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-Tyr-OH also binds DNA by bisintercalation. This sequence is based on the C-terminal tandem repeat of RNA polymerase II with an additional tyrosine attached at the N-terminus of the heptad sequence Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-Tyr. The intramolecular hydrogen bonds are responsible to fold this linear octapeptide into the Triostin A like tertiary structures. This system shows different free and bound state structures with DNA. In this work, efforts are given to replace the hydrogen-bonded nine-membered rings (β-turns) by covalently bound nine-membered rings. The idea was to develop a system with more rigid backbone so that the bisintercalating conformation should be highly populated. Due to substitution of the tyrosine units with nucleobase units, the sequence of the peptide backbone was varied. Therefore, in this work, attempts are made to synthesize the cyclic molecule 5 using solution phase synthesis in order to obtain the nucleobase-functionalized peptide 4 through solid phase peptide synthesis (SPPS) (Figure 5.4).
Figure 5.4: Cyclic molecules 5, 70, 62; desired more constrained nucleobase substituted linear octapeptide 4.
Cyclization was only successful using the D-proline to afford compound 62 (Figure 5.4). This indicates that the epimeric proline has sterical influence in the formation of the covalently linked nine-membered ring.
All efforts to get molecule 70 (Figure 5.4) were not successful but the synthesis of this compound along with its incorporation to afford the constrained linear peptide 4 will give an idea about the influence of the induced constraint through covalently formed nine-membered ring in the linear backbone of the nucleobase-functionalized octapeptide.
Finally, the study of the non-covalent complexes of nucleobase-functionalized β-peptides was also carried out using FTICR-ESI mass spectrometry, which is used extensively to investigate the non-covalent interactions between biomolecules (Appendix 8.2). Using the Pentabromopseudiline, a cytotoxic natural product, the abstraction of the nucleobase was also investigated by FTICR-ESI-MS experiments. These studies showed the selective removal of the adenine nucleobase from a G-C rich Dickerson Dodecamer (Appendix 8.1). A further and detailed study will provide the mechanism of action of this compound which is responsible for its cytotoxic activity.
Autor*in
Anmol Kumar Ray
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