Influence of cycle stage, age and biopsy score on oxytocin receptor gene expression and distribution in the cervix and uterus of non-pregnant mares
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Beschreibung
Der Einfluss des Sexualzykluses, des Alters und der Biopsie Kategorien auf die Genepression und Verteilung des Oxytocin Rezeptors in der Zervix und der Gebärmutter von nicht-tragenden Stuten
Jedes Jahr werden zahlreiche Stuten trotz optimalem Zuchtmanagement (kein offensichtlicher Grund für Unfruchtbarkeit bei der Stute, gute Samenqualität des Hengstes, korrektes Timing der Besamung, gute Besamungstechnik und Management nach der Besamung) nicht trächtig (Da Silva 2008). Diese Stuten werden als subfertil bezeichnet (Da Silva 2008). Verschiedene Fortpflanzungspathologien können dazu fuehren, dass eine Stute nicht trächtig wird oder in einem frühen Stadium Fruchtresorption erleidet. Pathologische Veraenderungen der Gebärmutter, wie Endometritis nach der Deckung, werden als einer der Hauptgründe dafür gesehen (Carnevale 2008).
Die uterine Säuberung ist einer der wichtigsten Bestandteile des Abwehrsystems gegen Infektionen (Troedsson 1999). Stuten, die unfähig zur effizienten uterinen Selbstreinigung sind und folglich unfähig sind, die vorübergehende physiologische Endometritis zu beheben, unterliegen einer großen Wahrscheinlichkeit eine chronische Endometritis nach der Deckung zu entwickeln. Diese führt zur längeren Entzündung der Gebärmutterschleimhaut und somit zum Verlust des Embryos und zur Unfruchtbarkeit (Troedsson 1999; Troedsson et al 2001;. Watson 2000). Oxytocin, ein Neuropeptidhormon, das vom Hypothalamus und Endometrium der Stute produziert wird (Behrendt-Adam et al. 1999; Handler 2001; Gimpl und Fahrenholz 2001; Bae und Watson 2003), ist hauptverantwortlich für die Kontraktionen der glatten Muskulatur im Eileiter, der Gebärmutter und der Myoepithelzellen der Brustdrüse im Pferdereproduktionstrakt und damit wichtig fuer die uterine Säuberung (Handler 2001). Oxytocin wird zusätzlich bei der Luteolyse als wichtig erachtet (Betteridge et al 1985; Goff et al 1987; Goff et al., 1993). Oxytocin wirkt auf das Zielgewebe ein, indem es an seine Rezeptoren bindet. Oxytocin Rezeptoren (OR) wurden in verschiedenen Geweben auch außerhalb des Genitaltraktes (Gimpl und Fahrenholz 2001) beschrieben.
Die bedeutende Rolle von Oxytocin im Sexualzyklus der Stute sowie bei der uterinen Säuberung erklärt die Notwendigkeit, die Lokalisation von ORs im Reproduktionstrakt (Endometrium, Myometrium und Zervix) von Stuten zu untersuchen. Früheren Studien war es möglich Veränderungen in der Konzentration von ORs in Endometrium des Pferdes während des Sexualzyklus mit einem Höhepunkt im späten Diöstrus aufzuzeigen. Es gibt jedoch keine Analysen, welche die OR Dichte und Verteilung im Myometrium und Gebärmutterhals der nicht trächtigen Stute zwischen verschiedenen Zyklusstadien vergleichen. Trotz des begründeten Verdachts, dass Oxytocin eine wichtige Rolle im Gebärmutterabwehrmechanismus und damit für die Fruchtbarkeit der Stute spielt, gibt es keine Studie, die genauere Auswirkungen untersucht.
Die vorliegende Studie untersucht mit Hilfe von Immunohistochemie (IHC) und quantitativer reversetranscription polymerase chain reaction (RT-qPCR) die OR Verteilung und Dichte im Endometrium, Myometrium und in der Zervix der Stute während der Gelbkörper und Nicht-Gelbkörperphase, sowie in verschiedenen Fruchtbarkeitsgruppen (basierend auf der Alter und Endometriumbiopsiekategorie).
Als Forschungsproben wurden transmurale Uterusbiopsien sowie eine Endometriumbiopsie von 27 routinemäßig geschlachteten, zyklischen Stuten verschiedener Rassen und Altersgruppen (10 Stuten> 10 Jahre alt, 17 Stuten <10 Jahre alt) von 3 verschiedenen Stellen im Uterus (Corpus uteri, rechtes und linkes cornus uteri) und von der Zervix entnommen. Schnitte der Endometriumbioptate wurden mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardtechniken gefärbt und anschließend entsprechend dem Kenney und Doig Kategorisierungsschema den Kategorien I, IIa, IIb oder III zugeordnet. Für die IHC wurden alle Endometrium-, Myometrium- und Zervixproben mit einem Immunperoxidase-Detektionssystem und einem polyklonalen Antikörper gegen humane ORs immunmarkiert. Die Schnitte wurden unter Verwendung eines Olympus Lichtmikroskop und der Olympus cell sens Dimension Software ausgewertet. Weitere Proben vom linken Uterushorn (Endometrium und Myometrium) und der Zervix wurden für einen RT-qPCR-Assay verwendet. Zum Nachweis von ORs und β-Actin Genexpression wurden Oligonukleotid-Primer und Sonden-Sequenzen verwendet, mit welchen bereits in drei früheren Studien ORs im Pferdekonzeptus, fötalen Membranen,im Endometrium von Ponystuten bei der Geburt und in Endometrium, Myometrium und Zervix von nichtträchtigen Stuten nachgewiesen werden konnten. Mit Hilfe der RT-qPCR wurde die messenger-ribonucleic acid (mRNA) ermittelt und das ΔΔCt Verfahren unter Verwendung der StepOnePlus™ Software zur Analyse der Daten herbeigezogen.
Fünf (18,52%, 1 alte Stute und 4 junge Stuten) Stuten konnten der Kategorie I, sechzehn (59,26%, 6 Stuten und 10 junge Stuten) der Kategorie IIA und sechs (22,22%) der Kategorie IIB des Endometriumbiopsiekategorieschemas zugeordnet werden. Keine der Stuten in der Studienpopulation wurde in die Kategorie III eingeteilt. Alle Stuten der Kategorie I befanden sich in der Gelbkörperphase und alle Stuten der Kategorie IIB in der Nicht-Gelbkörperphase ihrer Zyklen.
Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Biopsiekategorien zwischen alten und jungen Stuten festgestellt werden (P = 0,386). Pferde in der Nicht-Gelbkörperphase hatten jedoch eine signifikant schlechtere Einordnung in Biopsiekategorien (I = beste Kategorie, III = schlechteste Kategorie) im Vergleich zu Pferden in der Gelbkörperphase (P = 0,003).
Oxytocin Rezeptoren konnten mittels Immunmarkierung als feine braune Granula im Zytoplasma von ausgewählten Zellen sowohl im Negativ- als auch im Positiv-Kontrollgewebe und in den Testabschnitten identifiziert werden. Zwischen Stuten in Gelbkörper- und Nicht-Gelbkörperphase, alten und jungen Stuten und zwischen Stuten mit verschiedenen Biopsiekategorien konnte weder ein Unterschied in der OR Verteilung, noch in der Intensität der Färbung nachgewiesen werden.
Die RT-qPCR Analyse zeigt höhere OR-Genexpressionen während der Nicht-Gelbkörperphase im Myometrium (26 mal), Endometrium (2 mal) und der Zervix (3 mal) in Bezug auf die Expression von OR-Genen während der Gelbkörperphase. Statistisch gesehen besaß das Myometrium signifikant mehr ORs während der Gelbkörperphase als während der Nicht-Gelbkörperphase (P = 0,004). Es gab keinen signifikanten Unterschied für die OR-Konzentrationen im Endometrium (P = 0,0574), und in der Zervix (P = 0,339) in unterschiedlichen Zyklusphasen.
Die statistische RT-qPCR Analyse wies weder einen signifikanten Unterschied zwischen der OR-Genexpression in jungen und alten Pferden nach, noch zwischen Pferden mit unterschiedlichen Biopsiekategorien.
Autor*in
Ruth Ströhle
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