Genome sequencing and molecular typing of Clostridium chauvoei

Beschreibung

Genomsequenzierung und molekulare Typisierung von Clostridium chauvoei Zwei vollständige, zirkuläre Genomsequenzen von hoher Qualität wurden für den Clostridium chauvoei Typstamm DSM 7528T (ATCC 10092T) und dem in Deutschland isolierten Feldstamm 12S0467 generiert. Die vergleichende Genomanalyse der beiden Stämme zeigte wenige Inversionen und Translokationen in lokal kollinearen Blöcken. Dies weist auf ein konserviertes Genom mit nur einer kleinen Anzahl von Zusatzgenen hin. Für C. chauvoei wurde eine signifikante Homologie mit C. septicum beobachtet. Das Speziesgenom beinhaltet zudem eine große Anzahl von Genen, deren Produkte an Proteolyse, der Spaltung von glycosidischen Bindungen (Sialidasen) und Metallionen-Transport beteiligt sind. In jedem der beiden vollständigen Genome wurden drei Kopien des Gens fliC identifiziert. Sporulations- und Keimungsprozeß-bezogene Gene waren homolog zu denen anderer Arten des Clostridien Clusters I, mit der höchsten Homologie zu C. septicum. Aber es wurden auch neue Variationen in diesen regulatorischen Genen identifiziert. Eine vergleichende genomische Studie wurde mit insgesamt 64 C. chauvoei-Stämmen durchgeführt. Die Stammsammlung enthielt zum größten Teil Stämme europäischer Herkunft, während wenige Stämme exotischen Ursprungs waren. Die Pan-Genom-Analyse der verfügbaren C. chauvoei Stämme zeigt, dass die Spezies eine offene Pan-Genom-Struktur aufweist. Die Akquisition neuer Gene wurde selten beobachtet. Dies deutet wahrscheinlich darauf hin, dass die Spezies nur in sehr isolierten Bereichen repliziert, z. B. innerhalb des Wirtsgewebes, sodass die Chancen, fremdes genetisches Material zu erwerben, begrenzt sind. Der in den Genomen identifizierte Prophage war bei allen Stämme gleichartig, was darauf hinweist, dass die Genome dieser Spezies für jeden neuen Phagentyp immun sind. Ein CRISPR-Typ-I-B-System wurde in allen Genomen identifiziert, dieses trägt wahrscheinlich zur umfassenden Phagen-Immunität bei. Es gibt eine offensichtliche Übereinstimmung der Repeat-Zahlen/Spacer-Sequenzen der Stämme aus der gleichen Region/aus dem gleichen Betrieb. Stämme mit geographischem Ursprung außerhalb Europas hatten eine einzigartige Spacer-Matrix Zusammensetzung. Homologe Rekombination spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einiger bakterieller Pathogene. Diese Studie weist lediglich auf eine eingeschränkte Anzahl von möglichen Rekombinationsereignissen hin, die zur Evolution von C. chauvoei beigetragen haben. Die „Maximum-Likelihood“ phylogenetische Sequenzanalyse basierend auf dem Core-Genom (Parsnp) identifizierte zusammengehörige Isolate mit hohen Bootstrap-Test-Werten (100%). Diese waren besonders markant bei Isolaten, die aus demselben Ausbruch/Betrieb/Tier stammten. Referenzgenom- und Alignment-freie (kSNP3) Analysemethoden auf der Basis von Pan-Genom-SNPs (SNP, engl. Single Nucleotide Polymorphism, Einzelnukleotid-Polymorphismus) waren für das initiale Clustering von Isolaten geeignet. Das Clustering der Stämme erfolgte anhand spezifischer SNPs. Die Anzahl allel-spezifischer SNPs, die für jeden Stamm einzigartig sind, war bei Stämmen exotischen Ursprungs höher. Read-mapping und SNP-calling (Snippy), auf der Basis eines verwandten Referenzgenoms (12S0467) können neue Einblicke zum Verständnis der generellen, ausbruchsbezogenen und im Wirt ablaufenden Mikroevolution eines Erregers ermöglichen. Der mediane paarweise SNP-Differenzwert war für Stämme aus Bayern und Österreich im Vergleich zu Stämmen aus Niedersachsen höher. Die Diversität geographisch verwandter Stämme könnte darauf hinweisen, dass Umweltfaktoren oder das Herden-Management die Mikro-Evolution der Stämme beeinflussen. Nicht-synonyme SNPs trugen wesentlich zu der beobachteten Mikro-Evolution des Erregers bei. Die beobachtete Variabilität von Stämmen aus dem gleichen Tier und Stämmen aus dem gleichen Ausbruch zeigt, dass genetisch verschiedene C. chauvoei Populationen in einem Wirt vorhanden sein können. Eine kürzlich publizierte, auf Genomsequenzdaten basierende Studie hat gezeigt, dass CRISPR-Spacer-Sequenzen von C. chauvoei für die Stamm-Differenzierung genutzt werden können. Die aktuelle Studie beweist die Eignung von CRISPR-Typing und Core-Genom MLST. Bei den hier untersuchten Stämmen war die Diversität der CRISPR-Spacer-Sequenzen nicht ausreichend, um Stämme europäischen Ursprungs weiter zu differenzieren. Mittels Core-Genom MLST war die Differenzierung von Stämmen mit europäischem und deutschem Ursprung möglich. Sie ist deshalb ein wertvolles Werkzeug zur Unterscheidung von Stämmen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Vorteil von Sequenzier-Techniken mit langen Leseweiten genutzt, um zwei qualitativ hochwertige, komplette Referenz-Genomsequenzen für ein Feldisolat aus Deutschland und den Typstamm von C. chauvoei zu erzeugen. Die phylogenetische Position der Spezies innerhalb des Genus wurde evaluiert und eine nahe Verwandtschaft zu C. septicum bestätigt. Verschiedene Genom-Analyse-Programme ermöglichten neue Einblicke in die Genomzusammensetzung und in den Genominhalt des Erregers. Eine vergleichende Genomsequenz-Analyse anhand von 64 Stämmen zeigte für den Erreger einen eingeschränkten horizontalen Gentransfer und eingeschränkten Erwerb neuer Gene. Die Typisierung von Stämmen auf der Basis der Core-Genom MLST, die zum ersten Mal für die Spezies untersucht wurde, ermöglichte sogar die Differenzierung von Stämmen auf Betriebsebene.

Autor*in

Prasad Thomas

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CRISPR MLST clostridium chauvoei clustered regularly interspaced short palindromic repeats comparative genomics gangrene genome analysis germany multi-locus sequence typing phylogeny

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