Development of a microfluidic device for mitochondria isolation from cell culture

Beschreibung

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Energiegewinnung vieler eukaryotischer Zellen. Jedoch werden bis heute die Intermediate vom Zytosol und von Mitochondrien als eine Gesamtheit betrachtet. Aufgrund von fehlenden experimentellen Daten konnten die Dynamik und die regulatorischen Mechanismen in Mitochondrien, beziehungsweise an der Schnittstelle zwischen Zytosol und Mitochondrien bislang noch nicht vollständig geklärt werden. Eine der Schwierigkeiten liegt in der Fraktionierung des hochkomplexen und heterogenen Zelllysats. Standardlabormethoden, wie z.B. die Differentialzentrifugation oder die Elektrophorese können keine Proben unter physiologischen Bedingungen erzeugen. Für Proteomstudien sind diese Methoden nicht spezifisch genug und zudem sehr zeitintensiv. In dieser Arbeit wurde eine neue mikrofluidische Isolationsmethode für Mitochondrien nach der Zelllyse entwickelt. Die Methode nutzt die Affinität zwischen Antigenen und Antikörpern. Der Mikrochip besteht aus linearen Kanälen in PDMS, welche mit einem Deckglas abgedichtet werden. Spezifische Antikörper gegen Mitochondrien sind auf der Kanaloberfläche immobilisiert, so dass die Mitochondrien in den Kanälen zurückgehalten werden, während der Rest des Zelllysats ungehindert weiterfließen kann. In dieser Arbeit wurde die erfolgreiche Immobilisierung von vorkonzentrierten Mitochondrien sowie Mitochondrien direkt aus dem Zelllysat gezeigt. Der Mikrochip wurde optisch mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Für ein besseres Verständnis der Bindungsdynamik wurde außerdem ein mathematisches Modell erstellt. Das Model basiert auf der Antikörper-Antigen Bindungsreaktion und berücksichtigt den Effekt der Flussrate auf die Immobilisierung der Mitochondrien. Das Modell konnte die experimentellen Daten gut nachbilden und ist für weiteres Experimentdesign sehr nützlich. Sowohl in den experimentellen, als auch in den Simulationsergebnissen wurde gezeigt, dass die Ausbeute von der Probenahmezeit, der Antikörperdichte auf der Oberfläche, der Mitochondrienkonzentration in der Lösung sowie der Flussrate abhängig ist. Weiterhin ist es möglich die immobilisierten Mitochondrien direkt auf dem Chip zu analysieren und zu beobachten, ohne diese zuvor zu eluieren. Dieses Prinzip wurde bei einer Analyse der Atmung von immobilisierten Mitochondrien auf dem Chip gezeigt. Die immobilisierten Mitochondrien waren aktiv und konnten verschiedene Substrate zur Bildung von ATP verwerten. Verschiedene Kanalsegmente konnten unterschiedlich und unabhängig voneinander modifiziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene Biomarker auf mehreren Kanalsegmenten zu immobilisieren und somit unterschiedliche Organnellen gleichzeitig zu beobachten.

Autor*in

Sabrina da Luz

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Lab-on-Chip PDMS avidin-biotin covalent protein immobilization mitochondria immobilization polydimethylsiloxane

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