Evaluation and pathophysiological characterisation of a bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection

Beschreibung

Evaluierung und pathophysiologische Charakterisierung eines bovinen Modells der respiratorischen Chlamydia psittaci Infektion Einleitung: Chlamydia (C.) psittaci ist ein gram-negatives, obligat intrazelluläres Bakterium, welches in der Lage ist, respiratorische Erkrankungen und persistente Infektionen bei Menschen und Vögeln zu induzieren, und dessen zoonotisches Potential schon lange bekannt ist. Das Wirtsspektrum erweiterte sich mit der Verbesserung molekularbiologischer Nachweismethoden auf diverse Wild- und Haussäugetiere. Bislang sind jedoch die pathogenetische Bedeutung und die funktionellen Konsequenzen der C. psittaci Infektion für die Säugetierlunge nur unzureichend erfasst. Ziele und Projektdesign: Um die Pathogenese der respiratorischen C. psittaci Infektion in der Säugetierlunge besser zu verstehen und um das pathogenetische und epidemiologische Potential von C. psittaci bei Rindern bewerten zu können, bestand das Ziel des vorgestellten Projekts in der Etablierung und Charakterisierung eines bovinen Modells der experimentell induzierten respiratorischen C. psittaci Infektion. Hierfür war zunächst zu klären, ob mit einem C. psittaci-Stamm boviner Herkunft unter experimentellen Bedingungen eine in ihrem Schwergrad von der Inokulationsdosis abhängige, klinisch manifeste Erkrankung im Kalb induzierbar ist (STUDIE 1). Darauffolgend waren die dosisabhängigen Effekte dieser C. psittaci-Infektion auf die Gasaustauschfunktion der Lunge, die angeborenen Immunabwehrmechanismen und die Akute-Phase-Reaktion pathophysiologisch zu charakterisieren (STUDIE 2). Des Weiteren galt es zu eruieren, ob bzw. wie der Erreger sich im Wirtsorganismus ausbreitet, wie lange und über welche Wege er ausgeschieden wird, ob die Infektion spontan von Tier zu Tier übertragbar ist, und wie sich eine spontan erworbene Infektion von einer experimentell induzierte Infektion im Hinblick auf das klinische Bild und die pathophysiologischen Mechanismen unterscheidet (STUDIE 3). Die Evaluierung der durch C. psittaci induzierten pulmonalen Dysfunktionen und Störungen des Säuren-Basen-Gleichgewichts waren Inhalt von STUDIE 4 und dienten dem Ziel, die wesentlichsten Funktionsstörungen auf Organebene aufzuklären, die dem klinischen Bild der induzierten akuten respiratorischen Erkrankung zugrunde liegen. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 69 Holstein-Friesian Kälber im Alter von 6 bis 9 Wochen in das Gesamtprojekt eingeschlossen und wie folgt experimentell belastet: - intrabronchiale Applikation von lebensfähigen C. psittaci, Stamm DC 15 (n = 35) - intrabronchiale Applikation von UV-inaktivierten C. psittaci, Stamm DC 15 (n = 6) - intrabronchiale Applikation von Zellkultur-Medium (n = 25) - naive Sentinel-Kälber, die mit akut erkrankten Kälbern (nach experimenteller Applikation lebensfähiger C. psittaci) vergesellschaftet wurden (n =3). Alle intrabronchialen Applikationen erfolgten nach einem standardisierten Inokulationsschema, wonach je Tier 6 ml Inokulat in definierten Portionen an 8 definierten Lokalisationen abgesetzt wurden. STUDIEN 1 & 2: Zur Beurteilung der Dosis-Wirkungs-Beziehung erhielten 14 Tiere Dosen von 106 bis 109 einschlussbildenden Einheiten (EBE) lebensfähiger C. psittaci pro Kalb. Der Vergleich zu zwei Kontrollgruppen, denen entweder Zellkultur-Medium (n = 4) oder 108 UV-inaktivierte EBE/Kalb (n = 6) inokuliert wurden, ermöglichte die Bewertung von unspezifischen Effekten. STUDIEN 3 & 4: Auf der Basis einer standardisierte Inokulation von 108 EBE/Kalb (n = 21) wurden die pathophysiologischen Langzeit-Auswirkungen der akuten respiratorischen C. psittaci Infektion sowohl im intra-individuellen Verlauf als auch im Vergleich zu einer mit Zellkultur-Medium inokulierten Kontrollgruppe (n = 21) erfasst (Studienende 35 Tage nach Inokulation (dpi)). Des Weiteren wurden die Ausscheidungs- und Transmissionswege des inokulierten Erregers evaluiert. Die Einbeziehung von naiven Sentinel-Kälbern (n = 3) diente der Dokumentation des Krankheitsverlaufes nach spontan erworbener Infektion. Die Beurteilung der systemischen Wirtsantwort auf den Erreger basierte auf folgenden Kenngrößen: klinischer Score, Parameter der zellulären und humorale Immunantwort, Akute-Phase-Proteine, Parameter des Säuren-Basen-Status sowie Konzentrationen von Elektrolyten und Metaboliten im peripheren Blut. Lokale Entzündungsmechanismen innerhalb der Lunge wurden sowohl durch die Analyse von inflammatorischen Markern in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (Konzentrationen von Eicosanoiden und Gesamtprotein, Differentialzellbild) als auch mittels pathologischer und histologischer Untersuchungen charakterisiert. Die Erfassung der pulmonalen Dysfunktionen erfolgte quantitativ und qualitativ auf der Basis von arteriellen Blutgasen und Parametern der Hämoxymetrie sowie Parametern der Atmungsmechanik, des Atmungsmusters und der alveolären Ventilation. Für die Lungenfunktionstests standen nicht-invasive Methoden aus der Humanmedizin zur Verfügung (Impuls-Oszilloresistometrie, volumetrische Kapnographie, Helium-Dilution), die zuvor für den Einsatz am wachen Kalb unter Spontanatmung validiert worden waren. Für die Detektion des Erregers im Blut, im Lungengewebe, in Kot-, Nasen- und Augentupfern, sowie in der Ausatem- und Raumluft kamen Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methoden zum Einsatz (real-time PCR, Microarray). Ergebnisse: Dosis-Wirkungs-Beziehung und Infektionsverlauf Aus der experimentellen Inokulation des vitalen C. psittaci-Stammes resultierten reproduzierbare, von der Erregerdosis abhängige, klinische Bilder einer milden (106 EBE/Kalb), klinisch manifesten (107 bis 108 EBE/Kalb) oder schweren (109 EBE/Kalb) respiratorischen Erkrankung. Mit ansteigenden Erreger-Dosen stiegen zugleich die respiratorischen und klinischen Scorewerte, das Ausmaß der systemischen Entzündungsreaktionen, die Quantität und Qualität der pneumonischen Veränderungen und die Einschränkungen im pulmonalen Gasaustausch. Nach Inokulation des Erregers erreichte die akute klinische Krankheits-Phase 2 – 3 dpi ihren Höhepunkt und klang innerhalb von 7 – 10 dpi wieder ab. Sentinel-Kälber akquirierten die Infektion, bildeten aber keine vergleichbaren klinisch manifesten Symptome aus. Interessanterweise entwickelten sich in beiden Gruppen – also nach dem Abklingen der akuten Krankheitsphase bzw. nach der auf natürlichem Wege erworbenen Infektion – klinisch unauffällige, persistente Infektionsverläufe ohne restitutio ad integrum und ohne komplette Erreger-Elimination. Indikatoren hierfür waren eine bis ca. 5 Wochen nach Erregeraufnahme andauernde Bakteriämie, eine fortwährende Erregerausscheidung im Kot sowie leicht erhöhte Gehalte von Monozyten und Lipopolysaccharid-bindenden Protein im Blut. Pathogenese und Pathophysiologie Während der akuten Erkrankungsphase wurden Entzündungszellen, vor allem neutrophile Granulozyten, in die Lunge rekrutiert. Infektion und Entzündung der Lunge verursachten Gewebeschäden, Anreicherung von Detritus und proteinreicher Flüssigkeit, welche sowohl Obstruktionen der Atemwege als auch eine verminderte Dehnbarkeit des Lungengewebes (bis 11 dpi) zur Folge hatten. Die pathophysiologischen Konsequenzen dieser inflammatorischen Prozesse waren: alveolären Hypoventilation, ein reduzierter pulmonaler Gasaustausch sowie Hypoxämie, in deren Folge kompensatorisch die Atmungsfrequenz und das Atemminutenvolumen anstiegen. Imbalancen des Säuren-Basen-Gleichgewichts resultierten nicht nur aus pulmonalen Dysfunktionen, kompensatorischen Mechanismen oder anaerobem Metabolismus, sondern auch aus der Reduktion von Chlorid- und Natriumkonzentrationen im Blut sowie einer Hypoalbuminämie und Hypergammaglobulinämie. Nach experimenteller Infektion war der Erreger nicht nur im Lungengewebe, sondern auch in Blut, Kot, Nasensekret und in der Ausatemluft nachweisbar. Trotz kompletter täglicher Säuberung der Tierräume reichte diese Kontamination aus, um die Infektion auf naive Sentinel-Kälber zu übertragen. Obwohl diese Tiere nur milde klinische Krankheitszeichen entwickelten schieden sie den Erreger häufig aus, was auch auf ein Verbreitungsrisiko unter natürlichen Haltungsbedingungen schließen lässt. Die humorale Immunantwort war insgesamt schwach ausgeprägt. Nur zwei Drittel der experimentell inokulierten Kälber entwickelten gegen C. psittaci gerichtete Antikörper. Im Gegensatz dazu war bei keinem der 3 Sentinel-Kälber eine humorale Wirtsreaktion nachweisbar. Schlussfolgerungen: Das etablierte Modell leistet einen wertvollen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie und der komplexen pathogenetischen Interaktionen der C. psittaci Infektion in der Säugetierlunge. In der vergleichenden respiratorischen Medizin ist es von translationalem Nutzen, insbesondere da die Lungenfunktionstests eine gute Vergleichbarkeit der Daten zwischen Kalb und Mensch erlauben. In der Veterinärmedizin bietet dieses biologisch relevante Tiermodell eine solide Grundlage für weiterführende Studien zur Wirksamkeit von Vakzinen oder medikamentöser Behandlungen.

Autor*in

Carola Heike Ostermann

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