Generation of an Infectious Clone of Duck Enteritis Virus (DEV) – A Basis for Pathogenesis Studies and Vectored Vaccine Development

Beschreibung

Generierung eines infektiösen Duck Enteritis Virus (DEV) Klons – Eine Basis für Pathogenitätsstudien und Vektor basierende Impfstoffe Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Konstruktion eines infektiösen Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Klons des Duck Enteritis Virus (DEV) Stammes 2085. Dieser infektiöse Klon ermöglichte die Generierung eines Vektor-basierten DEV-Impfstoffes, welcher das Hämagglutinin (H5) eines hochpathogenen H5N1 aviären Influenzavirus (AIV) exprimiert. Im Anschluß wurde die gesamte Genomsequenz des DEV-Stammes 2085 bestimmt und mit dem Genom der DEV-Stämme VAC, Clone-03 und CHv verglichen. Für die Konstruktion des infektiösen Klons wurde eine Mini-F-Vektorsequenz mittels homologer Rekombination an Stelle des UL44 (gC) Gens in das Genom des Stammes 2085 eingebracht. Die DNA des daraus resultierenden rekombinanten Virus wurde in den Escherichia coli-Stamm MegaX eingebracht und daraus resultierende Klone analysiert. Derr korrekte DEV-BAC-Klon (p2085) wurde für spätere Mutagenese in den E. coli-Stamm GS1783 elektroporiert. Die Transfektion von Hühner- Embryofibroblasten mit p2085 führte zu DEV-spezifischen Plaques, die nach UV-Anregung grüne Autofluoreszenz aufwiesen, Dies ließ auf eine erfolgreiche Generierung eines infektiösen Klons des DEV Stammes 2085 schließen. Eine gC-negative Mutante wurde durch Deletion der Mini-F-Sequenzen mithilfe des Cre-Lox Rekombination genriert. Zudem wurde eine Virus- Revertante durch Ko-Transfektion von p2085 mit einem PCR-Produkt, das UL44-Sequenzen enthielt, erzeugt. Schließlich wurden H5-Sequenzen in p2085 eingebracht, um ein rekombinantes Virus herzustellen, welches das Hauptimmunogen des AIV exprimiert. Eine robuste Expression von H5 in mit der Rekombinante infizierten Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz sowie Western Blot nachgewiesen. Plaque-Größenbestimmungen zeigten, dass die Plaque-Größen von der gC-negativen Mutante signifikant größer (12%) waren als die des Parentalvirus 2085 oder der Revertanten (ANOVA, P<0,05), während die Plaquegrößen von der Fremdgene (H5 oder GFP) exprimierten, signifikant reduziert waren. Zwischen den DEVMutanten und parentalem oder revertantem DEV wurden keine signifikanten Unterschiede in en intrazellulär vorhandenen Virustitern bestimmt. Dagegen ließen Virustiter der Überstände infizierter Zellen eine signifikante Abnahme um mehr als das 700-fache im Falle des gCnegativen Viruses im Vergleich mit parentalem 2085 Virus erkennen. Zell-assoziierte Virustiter des gC-negativen DEV zeigten ebenfalls eine signifikante Abnahme um das 50- bis 500-fache gegenüber dem Elternvirus (ANOVA, P<0,05). Des Weiteren wurde das Genom der 2085 Stammes anhand des generierten BAC sequenziert. Das 2085-Genom ist 160.600 bp lang und kodiert für 78 offene Leserahmen (ORFs) (GenBank ID: 999965), eine Anzahl, die mit der des attenuierten DEV VAC-Stammes identisch ist (GenBank ID: EU082088.2). Ein Vergleich der Genomsequenzen von DEV 2085 und VAC mit Teil-Sequenzen des virulenten CHv Stammes und dem attenuierten Stamm Clone-03 wurde urchgeführt, um Nukleotid- oder Aminosäuren-Polymorphismen zu identifizieren, die potentiell zur Virulenz von DEV beitragen. In 24 der 78 ORFs wurden keine Aminosäure-Veränderungen identifiziert. Ein Ergebnis, das auf hohe Konservierung in DEV schließen lässt und das unabhängig vom Ursprung des Stammes oder seiner Virulenz ist. Des Weiteren wurden in 39 ORFs nicht-synonyme Nukleotid-Substitutionen entdeckt. Die verbleibenden 15 ORFs hatten Fragment-Insertionen bzw. –Deletionen, Verschiebungen des Leserahmens- oder nichtsynonyme Nukleotid-Substitutionen mit einem Effekt auf die Translations-Initiation oder Terminierung des jeweiligen Leserahmens. In 7 der 15 ORFs mit hoher, und 27 der 39 ORFs mit niedriger Variabilität wurden Polymorphismen ausschließlich in DEV 2085 gefunden, ein Befund, der wahrscheinlich im unterschiedlichen Ursprung dieses Stammes (Europa) gegenüber den drei ost-asiatischen Stämmen begründet ist. Fünf ORFs (UL2, UL12, US10, UL47 und UL41) mit Polymorphismen waren identisch zwischen dem virulenten DEV 2085 und CHv, unterschieden sich jedoch von den attenuierten Stämmen VAC oder Clone-03 und könnten potentielle DEV Virulenzfaktoren sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass (1) das Fehlen von DEV gC zur Zunahme der Plaquegrößen in vitro führt, (2) gC eine Rolle in der Freisetzung des DEV spielt und (3) die Konstruktion eines infektiösen DEV Klons eine schnelle Generierung von Vektor-basierenden Impfstoffen zulässt. Dazu ergab (4) der Verglich des europäischen DEV-Stammes 2085 mit den ost-asiatischen DEV-Stämmen VAC, Clone-03 und CHv, dass die ORFs UL2, UL12, US10, UL47 sowie UL41 potentielle DEV-Virulenzfaktoren darstellen werden.
Generierung eines infektiösen Duck Enteritis Virus (DEV) Klons – Eine Basis für Pathogenitätsstudien und Vektor basierende Impfstoffe Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Konstruktion eines infektiösen Bacterial Artificial Chromosome (BAC)-Klons des Duck Enteritis Virus (DEV) Stammes 2085. Dieser infektiöse Klon ermöglichte die Generierung eines Vektor-basierten DEV-Impfstoffes, welcher das Hämagglutinin (H5) eines hochpathogenen H5N1 aviären Influenzavirus (AIV) exprimiert. Im Anschluß wurde die gesamte Genomsequenz des DEV-Stammes 2085 bestimmt und mit dem Genom der DEV-Stämme VAC, Clone-03 und CHv verglichen. Für die Konstruktion des infektiösen Klons wurde eine Mini-F-Vektorsequenz mittels homologer Rekombination an Stelle des UL44 (gC) Gens in das Genom des Stammes 2085 eingebracht. Die DNA des daraus resultierenden rekombinanten Virus wurde in den Escherichia coli-Stamm MegaX eingebracht und daraus resultierende Klone analysiert. Derr korrekte DEV-BAC-Klon (p2085) wurde für spätere Mutagenese in den E. coli-Stamm GS1783 elektroporiert. Die Transfektion von Hühner- Embryofibroblasten mit p2085 führte zu DEV-spezifischen Plaques, die nach UV-Anregung grüne Autofluoreszenz aufwiesen, Dies ließ auf eine erfolgreiche Generierung eines infektiösen Klons des DEV Stammes 2085 schließen. Eine gC-negative Mutante wurde durch Deletion der Mini-F-Sequenzen mithilfe des Cre-Lox Rekombination genriert. Zudem wurde eine Virus- Revertante durch Ko-Transfektion von p2085 mit einem PCR-Produkt, das UL44-Sequenzen enthielt, erzeugt. Schließlich wurden H5-Sequenzen in p2085 eingebracht, um ein rekombinantes Virus herzustellen, welches das Hauptimmunogen des AIV exprimiert. Eine robuste Expression von H5 in mit der Rekombinante infizierten Zellen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz sowie Western Blot nachgewiesen. Plaque-Größenbestimmungen zeigten, dass die Plaque-Größen von der gC-negativen Mutante signifikant größer (12%) waren als die des Parentalvirus 2085 oder der Revertanten (ANOVA, P<0,05), während die Plaquegrößen von der Fremdgene (H5 oder GFP) exprimierten, signifikant reduziert waren. Zwischen den DEVMutanten und parentalem oder revertantem DEV wurden keine signifikanten Unterschiede in en intrazellulär vorhandenen Virustitern bestimmt. Dagegen ließen Virustiter der Überstände infizierter Zellen eine signifikante Abnahme um mehr als das 700-fache im Falle des gCnegativen Viruses im Vergleich mit parentalem 2085 Virus erkennen. Zell-assoziierte Virustiter des gC-negativen DEV zeigten ebenfalls eine signifikante Abnahme um das 50- bis 500-fache gegenüber dem Elternvirus (ANOVA, P<0,05). Des Weiteren wurde das Genom der 2085 Stammes anhand des generierten BAC sequenziert. Das 2085-Genom ist 160.600 bp lang und kodiert für 78 offene Leserahmen (ORFs) (GenBank ID: 999965), eine Anzahl, die mit der des attenuierten DEV VAC-Stammes identisch ist (GenBank ID: EU082088.2). Ein Vergleich der Genomsequenzen von DEV 2085 und VAC mit Teil-Sequenzen des virulenten CHv Stammes und dem attenuierten Stamm Clone-03 wurde urchgeführt, um Nukleotid- oder Aminosäuren-Polymorphismen zu identifizieren, die potentiell zur Virulenz von DEV beitragen. In 24 der 78 ORFs wurden keine Aminosäure-Veränderungen identifiziert. Ein Ergebnis, das auf hohe Konservierung in DEV schließen lässt und das unabhängig vom Ursprung des Stammes oder seiner Virulenz ist. Des Weiteren wurden in 39 ORFs nicht-synonyme Nukleotid-Substitutionen entdeckt. Die verbleibenden 15 ORFs hatten Fragment-Insertionen bzw. –Deletionen, Verschiebungen des Leserahmens- oder nichtsynonyme Nukleotid-Substitutionen mit einem Effekt auf die Translations-Initiation oder Terminierung des jeweiligen Leserahmens. In 7 der 15 ORFs mit hoher, und 27 der 39 ORFs mit niedriger Variabilität wurden Polymorphismen ausschließlich in DEV 2085 gefunden, ein Befund, der wahrscheinlich im unterschiedlichen Ursprung dieses Stammes (Europa) gegenüber den drei ost-asiatischen Stämmen begründet ist. Fünf ORFs (UL2, UL12, US10, UL47 und UL41) mit Polymorphismen waren identisch zwischen dem virulenten DEV 2085 und CHv, unterschieden sich jedoch von den attenuierten Stämmen VAC oder Clone-03 und könnten potentielle DEV Virulenzfaktoren sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass (1) das Fehlen von DEV gC zur Zunahme der Plaquegrößen in vitro führt, (2) gC eine Rolle in der Freisetzung des DEV spielt und (3) die Konstruktion eines infektiösen DEV Klons eine schnelle Generierung von Vektor-basierenden Impfstoffen zulässt. Dazu ergab (4) der Verglich des europäischen DEV-Stammes 2085 mit den ost-asiatischen DEV-Stämmen VAC, Clone-03 und CHv, dass die ORFs UL2, UL12, US10, UL47 sowie UL41 potentielle DEV-Virulenzfaktoren darstellen werden.

Autor*in

Jichun Wang

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Anatid herpesvirus 1 Duck enteritis virus Duck plague virus amino acid avian influenza virus bacterialartificial chromosomes genomes glycoproteins hemagglutinins nucleotide sequences vaccines vectors virulence

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