Expression and Purification of Arabidopsis Two-Component System Proteins, Diffraction Experiments with Crystals of Amide Synthetase NovL and Structure Determination of Human MAP Kinase p38 in Complex with Inhibitors

Beschreibung

Zweikomponentensysteme sind für Zellen ein eleganter Weg um auf äußere Reize zu reagieren und Zellprozesse zu regulieren. In Arabidopsis thaliana besteht das Zweikomponentensystem aus drei wichtigen Bestandteilen: Sensorhistidinkinasen (AHK), Phosphortransferproteinen (AHP) und Antwortregulatoren (ARR). Äußere Reize werden von den AHKs in Phosphorylisierungssignale mit Hilfe der AHPs durch eine His-Asp-His-Asp-Phosphorylierungskaskade an die ARRs weitergeleitet. ARR4 und ARR7 wurden gereinigt, doch eine erfolgreiche Kristallisierung wurde durch Aggregatbildung der Proteine verhindert. Auch AHP2 konnte nicht kristallisiert werden. Der durch Molekulardesign vorhergesagte α-helikale Charakter von AHP2 wurde mit Hilfe der CD-Spektroskopie bestätigt. Die Amidsynthetase NovL katalysiert einen wichtigen Schritt der Biosynthese von Novobiocin, einem Aminocoumarinantibiotikum, das durch Hemmung der DNA-Gyrase die Vermehrung von Gram-positiven Bakterien wie Staphylococcus aureus bremst. Eine Röntgenstruktur von NovL würde wertvolle Hinweise über die Substratspezifität des Enzyms liefern. In Röntgendiffraktionsexperimenten mit NovL-Kristalle konnten mehrere Datensätze gemessen werden. Die Röntgenstruktur konnte aber nicht bestimmt werden, da die Kristalle verzwillingt waren. Um die Struktur schrittweise zu lösen, wurde unter Verwendung eines durch Molekulardesign gewonnenen Models die Domänengrenzen in NovL bestimmt. Es wurden Konstrukte zur Expression der N-terminalen Domäne, NovLO, kloniert. Das Protein wurde erfolgreich exprimiert und gereinigt. Die Röntgendiffraktionsexperimente mit Kristallen von NovLO erreichten eine Auflösung von 9 Å. Die p38 MAP Kinase spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungskrankheiten wie rheumatischer Athritis, Morbus Crohn oder Asthma. Ein Wirkstoff, der diese Krankheiten wirksam bekämpft, würde die Lebensqualität der Betroffenen erheblich verbessern. Die gezielte Entwicklung von spezifischen Kinasehemmern setzt die genaue Kenntnis der Struktur der Kinasen in Wechselwirkung mit den Hemmstoffen voraus. Strukturen von drei Hemmstoffen im Komplex mit p38 MAPK wurden gelöst. Die Untersuchung der Strukturen ergab drei Merkmale, die die hohe Spezifität von Dibenzosuberonen erklären: Der Hemmstoff muss eine, in nur wenigen Kinasen frei zugängliche, Bindetasche füllen; er muss eine Wasserstoffbrückenbindung zu einem Glycin in der Gelenkregion der Kinase ausbilden und starr genug sein um die Flexibilität der Kinase auszugleichen.
Zweikomponentensysteme sind für Zellen ein eleganter Weg um auf äußere Reize zu reagieren und Zellprozesse zu regulieren. In Arabidopsis thaliana besteht das Zweikomponentensystem aus drei wichtigen Bestandteilen: Sensorhistidinkinasen (AHK), Phosphortransferproteinen (AHP) und Antwortregulatoren (ARR). Äußere Reize werden von den AHKs in Phosphorylisierungssignale mit Hilfe der AHPs durch eine His-Asp-His-Asp-Phosphorylierungskaskade an die ARRs weitergeleitet. ARR4 und ARR7 wurden gereinigt, doch eine erfolgreiche Kristallisierung wurde durch Aggregatbildung der Proteine verhindert. Auch AHP2 konnte nicht kristallisiert werden. Der durch Molekulardesign vorhergesagte α-helikale Charakter von AHP2 wurde mit Hilfe der CD-Spektroskopie bestätigt. Die Amidsynthetase NovL katalysiert einen wichtigen Schritt der Biosynthese von Novobiocin, einem Aminocoumarinantibiotikum, das durch Hemmung der DNA-Gyrase die Vermehrung von Gram-positiven Bakterien wie Staphylococcus aureus bremst. Eine Röntgenstruktur von NovL würde wertvolle Hinweise über die Substratspezifität des Enzyms liefern. In Röntgendiffraktionsexperimenten mit NovL-Kristalle konnten mehrere Datensätze gemessen werden. Die Röntgenstruktur konnte aber nicht bestimmt werden, da die Kristalle verzwillingt waren. Um die Struktur schrittweise zu lösen, wurde unter Verwendung eines durch Molekulardesign gewonnenen Models die Domänengrenzen in NovL bestimmt. Es wurden Konstrukte zur Expression der N-terminalen Domäne, NovLO, kloniert. Das Protein wurde erfolgreich exprimiert und gereinigt. Die Röntgendiffraktionsexperimente mit Kristallen von NovLO erreichten eine Auflösung von 9 Å. Die p38 MAP Kinase spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungskrankheiten wie rheumatischer Athritis, Morbus Crohn oder Asthma. Ein Wirkstoff, der diese Krankheiten wirksam bekämpft, würde die Lebensqualität der Betroffenen erheblich verbessern. Die gezielte Entwicklung von spezifischen Kinasehemmern setzt die genaue Kenntnis der Struktur der Kinasen in Wechselwirkung mit den Hemmstoffen voraus. Strukturen von drei Hemmstoffen im Komplex mit p38 MAPK wurden gelöst. Die Untersuchung der Strukturen ergab drei Merkmale, die die hohe Spezifität von Dibenzosuberonen erklären: Der Hemmstoff muss eine, in nur wenigen Kinasen frei zugängliche, Bindetasche füllen; er muss eine Wasserstoffbrückenbindung zu einem Glycin in der Gelenkregion der Kinase ausbilden und starr genug sein um die Flexibilität der Kinase auszugleichen.

Autor*in

Johannes Romir

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