Klonierung und Expression des murinen RPGR Exon1-19
Buch in deiner Nähe kaufen
Beschreibung
Die Retinitis pigmentosa (RP) zählt zur Gruppe der erblichen Netzhautdystrophien, die ein sehr komplexes Krankheitsbild mit unterschiedlichen Krankheitsverläufen aufweist und im Verlauf unter anderem zu Gesichtsfeldeinschränkungen und Erblindung führen kann. Die X-chromosomal vererbte RP stellt hierbei eine besonders schwere Form dar, die durch Mutationen in einer der beiden Hauptisoformen des RPGR Gens (RPGREx1-19 und RPGRORF15) gekennzeichnet ist. Die Isoformen zeichnen sich N-terminal durch die gleiche Sequenz, die auch RCC1-like domain (RLD) genannt wird, aus. In dieser Arbeit wurde ein Mausmodell (Rpgrtm1sti), welches zuvor durch Arbeitsgruppen der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen 2011 entwickelt wurde, genutzt. Durch eine dem Menschen ähnliche Punktmutation im ORF15 kommt es zur retinalen Degeneration. Ziel war die Klonierung und nachfolgende Expression eines rekombinant hergestellten RPGREx1-19 zur Generierung einer Positivkontrolle für zukünftige Westernblots. Zudem erfolgte die Testung eines neu designten Antikörpers, der gegen die RLD der beiden bekannten RPGR-Isoformen gerichtet ist. Dieser Antikörper sollte der genaueren Expressionsanalyse der bereits bekannten beiden Isoformen im Mausmodell dienen. Hierfür wurde die cDNA der RPGREx1-19 Isoform von Wildtypmäusen mittels Klonierung in XL1 Blue Zellen transformiert. In einem zweiten Schritt wurde mittels In-Fusion-Klonierung ein Expressionsvektor in BL21(DE3)-Zellen transfiziert und die Proteininduktion eingeleitet. Anhand dieser Proteinsequenz wurde ein Antikörper designt, welcher sowohl am rekombinant hergestellten Protein wie auch an verschiedenen murinen Gewebeproben im Westernblot getestet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass es sich bei der rekombinant hergestellten RPGREx1-19 Isoform um eine vermutlich neue Isoform dieses Proteins handelt, welche zudem im Hirn von Mäusen erfolgreich nachgewiesen werden konnte. Der neu designte Antikörper detektiert eine schwache Expression der bekannten RPGREx1-19 Isoform in Niere und Leber, was durch einen weiteren N-terminalen Antikörper bestätigt wurde. Mit dieser Arbeit konnten weitere Einblicke in die Expression verschiedener Isoformen, welche zu einem gewebespezifisch aber auch zum anderen speziesspezifisch zu sein scheint, gewonnen werden. Die neu detektierte Isoform des RPGREx1-19 und ihr Nachweis im Hirn unterstreicht die Bedeutung der verschiedenen gewebeabhängigen Isoformen für das Verständnis des Krankheitsbildes der XLRP. Da eine teilweise ubiquitäre Expression des RPGREx1-19 beschrieben worden ist und klinisch in Analogie auch syndromale Krankheitsverläufe bekannt sind, könnte das hier rekombinant hergestellte Protein als Positivkontrolle in der Diagnostik einen wertvollen Beitrag leisten.
Autor*in
Mirjam Laux